HALOTECH DNA SL ha desarrollado Halosperm® para la medida de la fragmentación de ADN. Es un test de diagnóstico in Vitro basado en la técnica SCD (Sperm Chromatin Dispersión) descrita por Fernández et al., 2003. El producto se ha validado mediante su comparación con otras técnicas disponibles en el mercado:
Técnicas para la medición de la fragmentación del ADN espermático: Base y Funcionamiento
| TÉCNICA | BASE | PARÁMETRO MEDIDO | MÉTODO DE DETECCIÓN |
|---|---|---|---|
| TUNEL | Adición de nucleótidos dUDP marcados con transferasa desoxinucleótido terminal. Los nucleótidos marcados se adicionan a roturas de ADN de cadena doble o sencilla | % de células con ADN marcado | Microscopía de fluorescencia o campo claro / citometría de flujo |
| Ensayo en COMETA | Electroforesis en condiciones alcalinas: se desnaturaliza el ADN para detectar roturas de cadena doble y sencilla. Electroforesis en condiciones neutras: se detectan roturas de doble cadena | % de células con colas de migración se corresponden a espermatozoides con ADN fragmentado | Microscopía de fluorescencia |
| SCSA | Tratamiento con ácido débil: desnaturaliza ADN con roturas de hebra doble o sencilla. Naranja de acridina: se intercala en el ADN y emite fluorescencia (verde si el ADN está intacto y rojo si el ADN presenta roturas) | Índice de Fragmentación de ADN (DFI): células con fluorescencia roja dividido por número total de células (rojas + verdes). Expresado como % | Citometría de flujo |
| SCD | Tratamiento con ácido débil desnaturaliza el ADN. Tratamiento con solución de lisis desproteinizante. Se observan células con un halo de descondensación de cromatina alrededor de la cabeza cuando el ADN está intacto. La ausencia de halo indica daño del ADN | % de células con halo pequeño o ausente respecto al total de células | Microscopía de campo claro o fluorescencia |
Los resultados obtenidos con Halosperm® son comparables a los obtenidos con TUNEL y SCSA
La fragmentación del ADN espermático fue analizada en donantes fértiles (n=7, línea continua) y pacientes infértiles (n=60, línea discontinua). Las correlaciones entre las distintas técnicas (izquierda, SCD y TUNEL, y derecha, SCD y SCSA) fueron analizadas usando el test t de Student y están destacadas encima de ambas gráficas. (Adaptado de: Chohan et al., 2006)
Las mismas células son teñidas usando TUNEL y Halosperm®
Espermatozoides incluidos en agarosa sobre un portaobjetos y procesados siguiendo los protocolos para TUNEL y SCD. (A,B,C,D – foto izquierda). Antes de usar Diff-quik, espermatozoides positivos para TUNEL se muestran teñidos de marrón. (A,B,C,D – foto derecha). Después de usar Diff-quik, los mismos espermatozoides positivos para TUNEL muestran la ausencia de halo mientras que los espermatozoides negativos para TUNEL muestran halo de dispersión. (Adaptado de: Zhang et al., 2009).
Ventajas y desventajas de técnicas de medida de fragmentación de ADN espermático alternativas a Halosperm®
| TÉCNICA | VENTAJAS | DESVENTAJAS |
|---|---|---|
| TUNEL | 1. Permite medir fragmentación en pocos espermatozoides 2. Para ciertos protocolos no es necesaria la utilización de un microscopio de fluorescencia o un citómetro de flujo |
1. Umbrales de corte no estandarizados 2. Protocolos variables 3. No diseñado para uso con espermatozoides 4. Procedimiento laborioso |
| Ensayo en COMETA | 1. Sensible 2. Permite medir fragmentación en pocos espermatozoides |
1. Umbrales de corte poco claros 2. Protocolos variables 3. Requiere software de análisis complicado |
| SCSA | 1. Muchas células analizadas 2. La mayoría de las publicaciones utilizan esta técnica |
1. Requiere equipamiento costoso 2. Pequeñas variaciones en condiciones de laboratorio pueden afectar los resultados 3. Cálculos basados en decisiones cualitativas |
Lista de ventajas competitivas ofrecidas por la técnica SCD - Kit Halosperm®
- Ha sido diseñado específicamente para uso con espermatozoides humanos. A diferencia de algunas otras técnicas, existe solo un protocolo que es altamente reproducible. Por ejemplo, un estudio reciente demuestra que pequeñas modificaciones en pasos cruciales de la técnica del TUNEL pueden alterar los resultados obtenidos de manera altamente significativa (Muratori et al., 2009).
- Es una de las técnicas mas económicas para la medición de la fragmentación del ADN espermático del mercado.
- Es la técnica más rápida del mercado. Un muestra puede ser analizada en menos de una hora, y varias muestras pueden ser procesadas a la vez.
- Es la técnica del mercado más simple y sencilla de uso. Solo se requiere equipamiento básico de laboratorio para utilizar el kit, y las muestras pueden ser analizadas con cualquier microscopio de campo claro.
- Puede ser utilizado con pocos espermatozoides, por ejemplo, en casos de oligozoospermia.
